Glossar - Störeffekte bei Immunoassays

Anti-Animal-Antibodies

Humane Anti-Animal-Antibodies (HAAA) werden als Immunantwort auf den Kontakt mit Immunglobulinen tierischen Ursprungs gebildet.
Sie können vom IgG-, IgA-, IgM- oder IgE-Typ sein.
HAAAs sind als wichtige Störer bei vielen diagnostischen Immunoassays bekannt, und bis zu 80% aller Patientenproben können – je nach veröffentlichter Studie – HAAAs enthalten.

Manche Störantikörper binden nicht nur an den Fc-Abschnitt, sondern auch direkt an die Fab-Bereiche der verwendeten Antikörper. Hierdurch kann die Bindung des Analyten reduziert oder sogar verhindert werden, und die Folge ist eine falsch-negative Bestimmung.

Aber auch falsch-positive Bestimmungen gehören zum klassischen Störbild von HAAA. Dies passiert z.B. wenn die Assay-Antikörper in Abwesenheit des Analyten von den HAAAs vernetzt werden und so positive Signale erzeugt werden.
Wenn HAAAs an den Fc-Abschnitt eines Antikörpers binden, spricht man von anti-isotypischen Störern, binden sie direkt an die hochvariable Region des Fab-Abschnitts, spricht man von anti-idiotypischen Störern.

Anti-idiotypische Antikörper

Anti-idiotypische Antikörper sind in der Lage, direkt an die hochvariable Region des Fab-Teils eines anderen Antikörpers zu binden.
Sie binden damit direkt an der Antigenbindungsstelle des anderen Antikörpers.
Anti-idiotypische Antikörper sind daher in der Lage, das eigentliche Antigen des anderen Antikörpers zu kompetieren bzw. zu verdrängen. Dadurch können sie in Immunoassays verschiedene Störungen verursachen.

Ein HAMA mit anti-idiotypischen Bindungseigenschaften zum Fängerantikörper. Der störende Antikörper bindet im Bereich der hochvariablen Region des Fab-Bereichs und verhindert so die Bindung des Analyten. Als Folge hiervon treten falsch negative Signale auf.
Ein HAMA mit anti-idiotypischen Bindungseigenschaften zum Detektorantikörper. Der störende Antikörper bindet im Bereich der hochvariablen Region des Fab-Anteils und verhindert so die Bindung des Analyten. Als Folge hiervon treten falsch negative Signale auf.

Anti-isotypische Antikörper

Anti-isotypische Antikörper sind Antikörper, die an den Fc-Anteil eines anderen Antikörpers binden können. Da sie auch an den Fc-Teil von Assay-Antikörpern binden können, sind Sie in der Lage, Störungen in Immunoassays zu verursachen.

HAMA

Human-Anti-Mouse Antibodies (HAMA) sind humane Antikörper, die relativ spezifisch Maus Antikörper binden.
Ursache für die Entstehung von HAMAs kann zum einen der langjährige Umgang mit Haustieren, aber auch die Gabe von therapeutischen Antikörpern als Medikamente für Krebstherapien sein. HAMAs stören immunologische Methoden, die mit Maus-Antikörpern arbeiten. Aufgrund der hohen Sequenzähnlichkeit zwischen den Antikörpern verschiedener Spezies sind HAMA-haltige Seren eventuell auch in der Lage, Assays zu stören, in denen Antikörper aus anderen Spezies verwendet werden.

Eine "Brückenbindung" durch HAMAs.
Hierdurch wird der Fängerantikörper mit dem Detektorantikörper verknüpft, sodass sich ein falsches positives Signal ergibt.

Heterophile Antikörper

Heterophile Antikörper sind Antikörper, die mit mehreren Antigenen kreuzreagieren. Sie binden also auch an mehrere andere Antigene als das spezifische Antigen. Sie sind multispezifische Antikörper der frühen Immunantwort oder störende Antikörper mit unbekannter immunologischer Entstehungsgeschichte. Sie können vom IgG-, IgA-, IgM- oder IgE-Typ sein.
Besonders der IgM-Typ spielt eine besondere Rolle bei Seren von rheumatischen Patienten. Diese Antikörper können an Fc-Abschnitte humaner Antikörper binden und somit auch artenübergreifend an Fc-Abschnitte der im Assay verwendeten Antikörper binden.
Daher verknüpfen rheumatische Seren Fänger- mit Detektorantikörpern mit der Folge von falsch-positiven Signalen. Die störenden Antikörper sind im Allgemeinen schwach bindende Antikörper und stören vorwiegend Assays, die aufgrund der niedrigen Konzentration des Analyten mit schwachen Verdünnungen der humanen Serum- oder Plasmaprobe auskommen müssen.

Eine "Brückenbindung" durch heterophile Antikörper. Hierdurch wird der Fängerantikörper mit dem Detektorantikörper verknüpft, sodass sich ein falsch positives Signal ergibt.

Hook-Effekt

Der Hook-Effekt oder auch high-dose-Hook-Effekt bezeichnet die falsch-niedrige Bestimmung von Analyten, die in sehr hoher Konzentration in Proben vorkommen.
Sobald die Analyt-Konzentration zu hoch ist, können alle Antikörper-Bindungsstellen mit Analyt belegt sein und die zusätzlichen Analyt-Moleküle werden nicht mehr im Rahmen der Bindungskurve ermittelt. Es kommt zu falsch-niedrigen Messwerten.
Durch parallele Messungen von verschiedenen Verdünnungen einer Probe kann das Vorliegen eines high-dose-Hook Effektes bemerkt und die Messung entsprechend korrigiert werden. Bekannte klinische Parameter, die einem high-dose-Hook-Effekt unterliegen können, sind beispielsweise CRP, AFP, CA 125, PSA, Ferritin, Prolactin und TSH.

Der Hook-Effekt. Hohe Konzentrationen des Analyten können falsch niedrige Messsignale vortäuschen.

Interferenz

Interferenzen sind Störungen in Immunoassays. Interferenzen äußern sich in mangelnder Richtigkeit von Messergebnissen. Sie sind teilweise durch Falsch-Positive oder Falsch-Negative Ergebnisse, zum Teil aber auch nur durch hohe Standardabweichungen bei Assays erkennbar.
Als Oberbegriff fasst man darunter Effekte mit unterschiedlichsten bekannten und unbekannten Ursachen zusammen, wie z.B. Matrixeffekte, Kreuzreaktivitäten und Störungen durch endogene Bestandteile von Proben. Die verschiedenen Interferenzen sind meist Hauptursache schlechter Werte von Richtigkeit, Präzision und Reproduzierbarkeit bei Immunoassays.

Kreuzreaktion

Bezeichnet die Fähigkeit des Antikörpers auch an andere Strukturen als die des eigentlichen Zielanalyten zu binden. Oftmals handelt es sich um Strukturen, die eine große Ähnlichkeit zum Analyten haben. Von Kreuzreaktivitäten wird gesprochen, wenn der Kreuzreaktand bekannt ist und dessen kreuzreagierende Eigenschaft nachgewiesen werden kann, z.B. über die Bestimmung der kompetierenden Konzentration der Kreuzreaktanden. Für viele klinische Parameter sind potentielle Kreuzreaktanden bekannt und müssen z.B. von Laborärzten bei Befunden entsprechende Berücksichtigung finden. Dies kann z.B. durch Parallel-Messung der bekannten Kreuzreaktanden erfolgen. Aus Kostengründen wird darauf jedoch meist verzichtet. Die Übergänge zu unspezifischen Bindungen sind fließend. Kreuzreaktionen lassen sich durch LowCross-Buffer® wirksam verhindern, sofern eine hohe Affinität der verwendeten Antikörper gegeben ist.

Der Fängerantikörper bindet an den Fc-Anteil des Detektorantikörpers. Der Analyt kann nicht mehr an den Fängerantikörper binden. Als Folge ergeben sich falsch positive Messsignale.
Kreuzreaktion eines Störers mit dem Fängerantikörper. Als Folge hiervon treten falsch negative Signale auf.
Kreuzreaktion eines Störers mit dem Detektorantikörper. Als Folge hiervon treten falsch negative Signale auf.
 
 

Matrixeffekte

Matrixeffekte sind die Summe der Störeffekte aller Komponenten, die in einer Probe vorkommen, und die Messung des Zielanalyten beeinflussen. Wenn die genaue molekulare Ursache einer Störung nicht bekannt ist, aber mit der Zusammensetzung der zu vermessenden Probe in Verbindung gebracht werden kann, spricht man im Allgemeinen von einem Matrixeffekt. Auch hier sind die Übergänge zu den einzelnen Störeffekten fließend. Für Matrixeffekte können „Anti-Animal-Antibodies“, heterophile Antikörper, endogene Störer oder Einflüsse der Viskosität, des pH-Wertes oder der Salzkonzentration verantwortlich sein. Mitunter bezeichnen Autoren nur die Einflüsse von Viskosität, pH-Wert und der Salzkonzentration als Matrixeffekte. Dies entspricht eher der englischen Sprachregelung, die zwischen „interference“ als Oberbegriff und „matrix effects“ als einem Teilaspekt von interference klarer unterscheidet.

Störungen durch endogene Bestandteile der Probe

Natürlich vorkommmende Proteine der Realprobe können Immunoassays stören.
Bekannte Störer in humanen Seren sind z.B. Albumine, Komplement, Lysozyme und Fibrinogen. Endogene Proteine können als Störer an die Assayantikörper binden oder den Zielanalyten für die Assayantikörper maskieren.

Kreuzreaktion eines endogenen Störers sowohl mit dem Fänger- als auch mit dem Detektorantikörper. Ein solches Phänomen ist in der Praxis eher selten, doch bei Antikörpern mit schlechter Spezifität durchaus möglich. Bei Antikörpern, die gegen ein Target mit konservierten Aminosäuresequenzen eines Proteins gerichtet sind, dessen Sequenzmotive auch bei anderen Proteinen vorkommen, kann ein solches Störungsbild vorkommen.
Maskierung des Analyten durch ein Protein der Probe, wodurch das Epitop für den Fängerantikörper blockiert wird, sodass die Bindung des Analyten entweder gar nicht oder -im Falle einer sterischen Behinderung- nur sehr schlecht erfolgen kann. Als Ergebnis hiervon ergeben sich falsch negative Signale.

Unspezifische Bindungen

Unspezifische Bindungen sind Bindungen der Assay-Antikörper, die nicht mit ihrer Spezifität in Zusammenhang stehen. Aber auch die Analyten können unspezifisch binden. Es gibt grundsätzlich zwei Arten von unspezifischen Bindungen, die im Laboralltag häufig nicht korrekt unterschieden werden, da sie ähnliche Ergebnisse hervorrufen können. Zum einen gibt es unspezifische Bindungen an Oberflächen wie z.B. ELISA-wells oder Western Blot-Membranen. In einem ELISA sieht man dann z.B. falsch-positive Ergebnisse bzw. hohen Hintergrund. Auch die zweite Gruppe von unspezifischen Bindungen führt im ELISA meist zu hohem Hintergrund. Hierbei handelt es sich um die Bindung an gelöste Substanzen, die in sehr hoher Konzentration vorkommen. Dies können z.B. Albumine oder auch Immunglobuline sein. Der erste Gedanke bei hohem Hintergrund im ELISA gilt daher häufig der Blockierung bzw. Absättigung der Oberflächen. Meist wird dabei aber die zweite Kategorie unspezifischer Bindungen, die nicht an einer Oberfläche stattfinden, übersehen. Diese sind meist nur durch die Benutzung moderner Puffer, wie LowCross-Buffer®, zu verhindern. Gerade die unspezifischen Bindungen der Analyten können anstelle von falsch-positiven auch falsch-niedrige Resultate hervorrufen. Dies geschieht z.B. wenn der Analyt teilweise unspezifisch an Albumine gebunden ist. Hierdurch liegt eine Maskierung des Analyten vor, wodurch er nicht durch die Assay-Antikörper erkannt wird. Auch hier hilft LowCross-Buffer®.

Unspezifische Bindung eines mit einem Label markierten Detektorantikörpers an eine nicht blockierte Oberfläche. Als Folge ergeben sich falsch positive Messsignale.
Unspezifische Bindung eines markierten Detektorantikörpers an eine blockierte Oberfläche. Trotz Blockierung der Oberfläche bindet der Antikörper an die Proteine der Blockierung. Als Folge ergeben sich falsch positive Messsignale.
Ein störendes Protein bindet an den Fc-Anteil des Detektorantikörpers und behindert dadurch sterisch die Bindung an den Analyten. Als Folge hiervon ergeben sich falsch negative Signale.
 
 
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