LowCross-Buffer®

LowCross-Buffer® ist ein neuentwickelter Probenpuffer für Immunoassays (insbesondere ELISA, Western Blots, Proteinchips und Immuno-PCR), der unerwünschte Störeffekte vermindert bzw. verhindert. Unerwünschte Störeffekte sind beispielsweise unspezifische Bindungen, Kreuzreaktivitäten und Matrixeffekte. Die hochaffine, spezifische Bindung des Antikörpers zum Analyten bleibt erhalten, während unerwünschte Bindungen des Antikörpers verhindert werden.

Ein großer Teil der sogenannten Matrixeffekte basiert auf unerwünschten niederaffinen Bindungen von Matrixbestandteilen (z.B. Serumproteinen bei Proben aus humanem Serum) an den Analyten oder an den Antikörper. Der Analyt kann durch Proteine oder andere Bestandteile der Probenmatrix maskiert sein, so daß der Antikörper nicht an das Zielepitop binden kann. LowCross-Buffer® verhindert diese Maskierung, so daß der Antikörper wie gewünscht den Analyten bindet. Auch die Antikörper können durch Matrixbestandteile maskiert werden. Hier verhindert LowCross-Buffer® die Maskierung und hebt vorhandene Maskierungen auf.

LowCross-Buffer® wird als Verdünnungspuffer der Realprobe (z.B. humanes Serum oder Plasma) und/oder als Verdünnungspuffer des Detektorantikörpers verwendet. Das hängt davon ab, wo der Störeffekt vermutet wird. Falls eine unspezifische Bindung oder Kreuzreaktivität beim Detektorantikörper vermutet wird, sollte z.B. der Detektorantikörper bevorzugt in LowCross-Buffer® verdünnt und eingesetzt werden.

LowCross-Buffer® ist eine "ready-to-use"-Lösung. Die Probe bzw. der Detektorantikörper wird also direkt im Puffer verdünnt. Lediglich in kompetitiven Assays und einigen Anwendungen der Immunhistochemie kann es sinnvoll sein, LowCross-Buffer® vor der Anwendung mit Wasser oder einem physiologischen Puffer zu verdünnen. In diesem Fall muß der Anwender über eine entsprechende Optimierung ein ideales Mischungsverhältnis ermitteln.

Ja. LowCross-Buffer® kann mit polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern verwendet werden. Bei polyklonalen Antikörpern ist jedoch folgendes zu beachten: Polyklonale Antikörper sind im Prinzip eine Mischung aus einer Vielzahl von Antikörpern mit unterschiedlichen Affinitäten. LowCross-Buffer® läßt nur hochaffine Bindungen zu, die niederaffinen und mittelaffinen Bindungen werden weitgehend unterdrückt. Daher kann es erforderlich sein, die Konzentration des polyklonalen Detektorantikörpers bei Verwendung von LowCross-Buffer® moderat zu erhöhen. Durch Erhöhung der Antikörperkonzentration erhöht sich die Konzentration der hochaffinen Antikörper, während die niederaffinen und mittelaffinen Antikörper weiterhin durch LowCross-Buffer® nicht binden können. Ob eine Erhöhung der Konzentration im Assay nötig ist, hängt demnach sehr stark von der Qualität der Antikörper ab.

Die enzymatische Aktivität der alkalischen Phosphatase oder der Peroxidase werden durch LowCross-Buffer® nicht negativ beeinflußt. Ganz im Gegenteil - Anwender berichteten von einer Erhöhung der Enzymaktivität, wenn der gelabelte Detektorantikörper mit LowCross-Buffer® inkubiert wurde.

Hierbei ist es wichtig zu wissen, ob der Sekundärantikörper präadsorbiert wurde, d.h. gereinigt wurde gegen Antikörper anderer Säugetierspezies. Beispielsweise kann ein Sekundärantikörper gegen „Rabbit-IgG“ auch hochaffin mit „Maus-IgG“ oder „Goat-IgG“ kreuzreagieren, es sei denn, er wurde gegen Antikörper dieser Spezies gereinigt. Ursache ist die hohe Sequenzhomologie der Antikörper der Säugetiere. Doch oftmals sind die Sekundärantikörper nicht gereinigt (präadsorbiert) und kreuzreagieren mit einer hohen Affinität. Dann kann auch LowCross Buffer® nicht helfen. In solchen Fällen muss der Sekundärantikörper gegen einen anderen präadsorbierten Sekundärantikörper ausgetauscht werden, der auf jeden Fall nicht mit dem Fängerantikörper kreuzreagiert. Die Firma Biotrend (Köln) hat beispielsweise sehr viele präadsorbierte Antikörper im Programm, mit denen sich diese Kreuzreaktivitäten vermeiden lassen.

Ja. Für Proteinchip-Anwendungen liegen positive Ergebnisse vor. Bei Cyan-Farbstoffen (z.B. Cy5, Cy3, Oyster-Farbstoffe) wurde sogar bei einigen Anwendungen eine Erhöhung der Fluoreszenz beobachtet.

Es ist problemlos möglich, den Puffer mehrfach einzufrieren und wieder aufzutauen. Es ist aber wichtig, daß der Puffer vor Benutzung nochmals aufgeschüttelt wird, um eine vollständige Durchmischung des Puffers sicherzustellen.

Nein! LowCross-Buffer® ist kein guter Blockierungspuffer von Oberflächen sondern sollte nur zur Verdünnung der Realprobe und der Assayantikörper verwendet werden. Für die Blockierung der Oberflächen empfehlen wir The Blocking Solution. Sie weist eine weitaus höhere Blockierungseffizienz auf, als die meisten bislang bekannten Blockierer