FAQ - ReadyTector®

Mit dem Einsatz von ReadyTector® beim Western blotting werden Blockierung und Immundetektion gleichzeitig ausgeführt. ReadyTector® blockiert und bringt Primär- und Sekundärantikörper in einem Schritt auf die geblottete Membran. Dies ist nur möglich, weil ReadyTector® die Membran auf viel schnellere und effektivere Weise blockiert, als dies mit klassischen Blockierern möglich ist. Daher „kleben“ die Primär- und Sekundärantikörper nicht unspezifisch an die Membran, obwohl sie gleichzeitig mit der Blockierung auf die Membran treffen. Es kommt also nicht zu unspezifischer Bindung und Hintergrund, die im klassischen Verfahren durch die verschiedenen Inkubationen und mehrfachen Waschschritte mühsam verhindert werden müssen. Somit werden einige Arbeits- und Waschschritte des klassischen Verfahrens eingespart.

Ja. Man kann die ReadyTector® Lösung mit dem Primär-Antikörper bis zu fünfmal wiederverwenden, ohne große Kompromisse bei der Ergebnisqualität. Die Detektion ist dabei immer genauso schnell und der Hintergrund bleibt niedrig. Natürlich verdünnt sich mit jeder Verwendung langsam der Primär-Antikörper, so dass ggf. die Banden etwas schwächer werden können. Dies kann aber einfach durch eine minimal längere Expositionszeit auf dem Röntgenfilm bzw. dem Chemilumineszenz-Detektor ausgeglichen werden. Häufigere Verwendung als 5-mal ist aber nicht zu empfehlen, weil sich die Blockierungsreagenzien und auch der Sekundär-Antikörper ebenfalls verbrauchen. Es gibt dann unschöne und ggf. nicht reproduzierbare Ergebnisse. Die gute ReadyTector®-Qualität ist also nicht mehr gegeben. Durch die bis zu 5-malige Verwendung läßt sich aber viel Lösung und Primär-Antikörper sparen. Es muss nur die passende Menge ReadyTector® Waschpuffer zusätzlich bestellt werden, wenn man auf diese Weise den primären Antikörper sparsam verwenden möchte.

Das Volumen für das Waschen und für die Detektion in der Packungsbeilage bezieht sich auf die Membrangröße für ein Minigel, also etwa 10 x 8 cm. Bei anderen Membrangrößen sollte man entsprechend auf die aktuelle Fläche umrechnen und weniger oder mehr Lösung einsetzen. Die Volumina sollten nicht deutlich reduziert werden, auch nicht bei Verwendung kleinerer Inkubationsgefäße oder bei der Verwendung von Röhrchen zur Inkubation, weil sonst zu wenig der Bestandteile der Lösungen auf die Membran einwirken können.

ReadyTector® mit HRP-gelabelten Sekundärantikörpern kann mit verschiedenen ECL-Substraten verwendet werden. Diese ECL-Substrate können sowohl auf Röntgenfilm als auch mit Chemilumineszenz-Imagern ausgelesen werden. ReadyTector® ist kompatibel mit diesen gängigen Detektionsmethoden. Auch die Detektion mit TMB-Substraten ist möglich, sofern die Proteinmenge auf der Membran groß genug ist.

ReadyTector® wird einfach in den klassischen Ablauf des Western blottings eingebaut. Die Schritte Proteintrennung und das Blotten bleiben unverändert. Die Behandlung der Membran bis zur fertigen Immundetektion wird durch ReadyTector® entscheidend vereinfacht und beschleunigt, da Blockierung und Immundetektion mit primären und sekundären Antikörpern gleichzeitig erfolgen. Die Detektion kann mit dem ReadyTector® Chemiluminescent Substrate verbessert werden, aber auch mit beliebigen anderen Substraten durchgeführt werden. Andere Substrate zeigen jedoch in der Regel erhöhten Hintergrund bzw. mehr Spots im Hintergrund.

ReadyTector® funktioniert mit allen gängigen Membrantypen, sowohl mit PVDF- als auch mit Nitrocellulose-Membranen. Auch Membranen für schnelle Blotter (sogenannte Turbo- oder Fast-Blotter) funktionieren problemlos mit ReadyTector®. Es wurden in umfangreichen Tests verschiedene Membranen vieler Hersteller getestet. Bislang wurde keine Membran gefunden, die Probleme bereitet.

ReadyTector® ist fertig einsetzbar und enthält alle Bestandteile, die für eine Einschritt-Immundetektion nötig sind. Sie müssen nur noch Ihren spezifischen Primärantikörper zugeben. Alle weiteren Reagenzien wie Blockierer und Sekundärantikörper-Konjugat sind bereits enthalten.

ReadyTector® Anti-Mouse HRP ist prinzipiell mit allen gängigen HRP-Substraten einsetzbar. Es funktioniert mit TMB-Substraten und mit den ECL-Substraten aller getesteten Hersteller. Im Rahmen der Testung ist jedoch aufgefallen, dass viele ECL-Substrate Hintergrund zeigen und zum Teil diverse Spots auf der Membran machen, obwohl die Immundetektion und die Blockierung einwandfrei funktioniert haben. Solche Spots können unabhängig davon auftreten, ob sequentiell mit dem alt-hergebrachten Verfahren oder der schnellen Einschritt-Immundetektion gearbeitet wird. Aus diesem Grund wurde das ReadyTector® Chemiluminescent Substrate dahingehend optimiert, dass noch weniger Hintergrund auftritt und vor allem die Spots reduziert sind. Zudem zeigten auch sehr teure „Femto“-Substrate keine bessere Nachweisgrenzen in unseren Tests als das ReadyTector® Chemiluminescent Substrate. Das ReadyTector® Chemiluminescent Substrate ist also universell einsetzbar für beliebige Proteinmengen.

Die ReadyTector® Kits enthalten die Detektionslösung mit dem sekundären Antikörper (z.B. Anti-Mouse mit HRP gelabelt) und eine Flasche 10fach ReadyTector® Waschpuffer. Wenn man die Detektionslösung mit dem eigenen Primär-Antikörper mehrfach verwenden möchte, benötigt man zusätzlich noch weiteren ReadyTector® Waschpuffer (Bestell-Nummer: 700500). Zudem braucht man ein Substrat. Für die ECL-Detektion empfehlen wir das ReadyTector® Chemiluminescent Substrate, weil es in der Kombination mit der neuartigen und schnellen Einschritt-Immundetektion deutlich geringeren Hintergrund und weniger Spots zeigt, als etablierte Substrate anderer Hersteller. Zudem ist es universell einsetzbar für hohe und auch extrem niedrige Proteinmengen. Aber prinzipiell funktionieren auch andere ECL oder TMB-Substrate.

Nein. ReadyTector® ist in der Lage, unspezifische Bindungen der Antikörper an die Membran weitgehend zu verhindern. Die Bindung des Sekundärantikörpers an Primärantikörper ist sehr gut und schnell. Damit wird trotz einer Verfahrensbeschleunigung durch ReadyTector® ein sehr gutes Ergebnis ohne Hintergrund erreicht.

In den meisten Fällen ist der Hintergrund mit ReadyTector® geringer oder genau so gering wie mit der klassischen Methode (wenn diese gut optimiert wurde). Der Hintergrund ist jedoch unter anderem von den Membranen und dem verwendeten Primärantikörper abhängig. Sofern es zu Hintergrund kommt, erhöhen Sie die Inkubationszeit mit ReadyTector® von einer Stunde auf zwei Stunden. In der Regel gibt es dann keinen Hintergrund mehr.

Die Arbeit mit ReadyTector® ermöglicht sehr gute Ergebnisse. Allerdings ist es sinnvoll, alle Komponenten des ReadyTector® Systems zusammen einzusetzen. Sowohl die Verwendung alternativer Waschpuffer als auch die Verwendung alternativer Substrate hat in Testungen immer wieder schlechtere Ergebnisse mit höherem Hintergrund, mehr Spots oder auch einer schlechteren Nachweisgrenze gezeigt. Andere Komponenten sind verständlicherweise nicht auf die neuartige all-in-one Detektion mit der hohen Geschwindigkeit optimiert und funktionieren daher hierbei schlechter.

Für den ersten Test können Sie einfach eine Membran mit dem zu detektierenden Protein in zwei identische Hälften teilen. Die eine Hälfte können Sie auf dem klassischen Wege detektieren. Diese Hälfte dient nur zur Kontrolle, ob das Protein auf der Membran vorliegt und der Primärantikörper überhaupt funktioniert. Für die Immundetektion der anderen Hälfte nutzen Sie ReadyTector®. Der Primärantikörper kann in der ersten Testung in maximaler Konzentration (0,5 µg/ml) eingesetzt werden. Dann werden beide Membran-Hälften detektiert und Sie können vergleichen, ob das Ergebnis mit dem getesteten Primärantikörper gut ist. Wer unsicher ist, ob sein Primärantikörper geeignet ist, sollte beim ersten Test die Inkubation mit der ReadyTector®-Lösung von einer auf zwei Stunden verlängern. Sofern nach zwei Stunden Inkubation mit ReadyTector® und Ihrem Primärantikörper kein Signal zu sehen ist, ist der primäre Antikörper nicht geeignet für eine Detektion mit ReadyTector®. Dies kann vor allem an der Affinität liegen, die u.a. die Geschwindigkeit der Bindung stark beeinflusst. In den meisten Fällen wird das Signal sehr gut sein. Dann können Sie in späteren Versuchen die Inkubationszeit auf etwa 1 Stunde oder weniger reduzieren und Sie erhalten meist ein ebenso gutes Ergebnis. Damit können Sie die Geschwindigkeit von ReadyTector® optimal nutzen. (Bei sehr guten Primärantikörpern sind auch Inkubationszeiten von nur 15 Minuten ausreichend.) Auch die Konzentration des Primärantikörpers lässt sich innerhalb des angegebenen Konzentrationsbereiches (0,2-0,5 µg/ml) meist noch reduzieren. Sollte im ersten Test nach zwei Stunden Inkubation mit einem Primärantikörper keine Bande zu sehen sein, ist der Primärantikörper entweder deutlich zu niedrig konzentriert oder für die rasche Einschritt-Immundetektion ungeeignet.

Nein. Das Diagramm ist die ganze Anleitung. Die Anwendung von ReadyTector® ist so einfach, dass man keine weitere Anleitung benötigt. Die geblottete Membran wird dreimal gewaschen. Der Primärantikörper wird der ReadyTector-Lösung zugefügt und etwa 1 h (ggf. auch kürzer, wenn der Primärantikörper hoch-affin ist) inkubiert und dann wird 3 bis 4 mal wieder mit dem ReadyTector® Waschpuffer gewaschen. Mehr ist nicht zu tun. Die Membran ist dann fertig für die Detektion mit einem Substrat. All das ist in im Anleitungsdiagramm zu sehen und man kann es sich noch zusätzlich im Anleitungsvideo auf der Webseite von ReadyTector® oder bei Youtube im ReadyTector®-Channel anschauen.
https://www.youtube.com/watch?v=hdjz6A2lC6o

Viele Hersteller geben die Konzentration der Antikörper nicht an. Bei solchen Antikörpern wird aber in der Regel angegeben, dass man für die Verwendung im Western Blot zum Beispiel 1:5000 verdünnen soll. Für die Verwendung mit ReadyTector® kann man sich exakt an diese Verdünnung halten. Bei bisherigen Tests haben sich die vom Hersteller auf diese Weise angegebenen Konzentrationen immer als wirksam für ReadyTector® gezeigt, auch wenn die Hersteller nicht mit ReadyTector® getestet haben.

Im Prinzip ja. ReadyTector® wurde schon bei einer größeren Zahl von verschiedenen Primärantikörpern mit Erfolg eingesetzt. Allerdings sollte der Primärantikörper spezifisch und mit einer guten Affinität das Zielprotein binden. Da die Hersteller-Angaben für Antikörper in Bezug auf das tatsächliche Bindeverhalten meist eher unklar formuliert sind, hilft nur eine Testung mit Ihrem speziellen Primärantikörper, um die Frage der Eignung sicher zu klären. Mit geeigneten Primärantikörpern und ReadyTector® sind identische Nachweisgrenzen erreichbar, wie es mit der klassischen mehrstufigen Immundetektion möglich ist. – Nur eben viel schneller und einfacher. ReadyTector® kann nur funktionieren, wenn man einen Primärantikörper aus der „richtigen Spezies“ verwendet. ReadyTector® Anti-Mouse HRP kann zum Beispiel mit primären Antikörpern aus der Maus, aber nicht mit primären Antikörpern aus Kaninchen oder anderen Spezies verwendet werden.

Ja. Die schnelle ReadyTector® Immundetektion erfordert Primärantikörper mit einer guten Affinität. Die allermeisten Antikörper zeigen eine solche gute Affinität. Es gibt jedoch auch viele Antikörper – auch kommerzielle von verschiedensten Anbietern – die nur eine sehr geringe Affinität zeigen. Solche Antikörper zeigen mit ReadyTector® schlicht eine weiße Membran ohne die gesuchte Bande. In einem solchen Fall kann man mit ReadyTector® eventuell bei einer 2-stündigen Inkubation noch die Banden sehen. Andernfalls muss man schlicht auf die althergebrachte sequentielle Weise detektieren. Zu empfehlen ist dann eine Über Nacht Inkubation des primären Antikörpers, weil er auf jeden Fall viel Zeit für eine gute Bindung benötigt.

Nein. Auch kommerziell erhältliche Antikörper aus den Katalogen der großen Hersteller haben nicht immer eine gute Affinität. Je schlechter die Affinität, desto höher ist immer auch das Risiko, dass der Antikörper andere Protein als das gesuchte ebenfalls bindet und damit falsche Banden erzeugt. Daher sollte man, wenn möglich, immer einen Antikörper suchen, der auch in ReadyTector® funktioniert, weil man so sicher ist, dass zumindest eine gute Affinität der Antikörper-Bindung gegeben ist. Eine gute Antikörper-Qualität hilft immer auch die Qualität der Forschungsergebnisse zu verbessern: Oder wie es die Briten kurz auf den Punkt bringen: „Garbage in … garbage out.“ Es lohnt sich also nach guten Antikörpern mit ordentlicher Affinität und Spezifität zu suchen, bevor man viele Messungen damit durchführt.

Im ReadyTector® ist ein gelabelter Sekundärantikörper enthalten, der sich optimal für eine Einschritt-Immundetektion eignet. Dieses Antikörper-Konjugat bindet besonders schnell und gibt gute und stabile Substratumsetzung. In vielen Testungen mit unterschiedlichen Primärantikörpern hat sich der ausgewählte Sekundärantikörper bewährt.

Weitere Spezies sind ebenfalls in Vorbereitung. Sofern Sie Bedarf an anderen Spezies haben, zögern Sie bitte nicht, bei CANDOR danach zu fragen.

Die ReadyTector®-Lösung und der ReadyTector® Waschpuffer sind optimal aufeinander abgestimmt. Bei der schnellen Einschritt-Immundetektion sind sowohl das Waschen der Membran vor der Detektion, als auch das Waschen vor Zugabe des Substrates sehr wichtige Schritte. Sie könnten natürlich auch andere Waschpuffer verwenden. Dann werden die Ergebnisse aber schlechter. Es gibt häufiger Hintergrund. Zudem kann auch die Bandenstärke deutlich sichtbar abnehmen. Wir empfehlen daher nur die Verwendung des ReadyTector® Waschpuffers. Er ist als 10fach Stammlösung in 500 ml Flaschen einzeln erhältlich.

Der erste Waschschritt nach dem Blotten dient unter anderem dazu, dass die Bestandteile des Transferpuffers wie z.B. Methanol oder Ethanol zuverlässig aus der Membran herausgewaschen werden. Zudem wird mit dem ReadyTector® Waschpuffer die Membran auf die extrem schnelle Blockierung vorbereitet und so eine unspezifische Bindung des primären und sekundären Antikörpers an die Membran zuverlässig verhindert. Diese Vorbereitung der Membran ist wichtig für reproduzierbar gute Ergebnisse. Es kann sonst zu Schlieren, vielen Spots oder auch flächigem Hintergrund auf der Membran kommen. Die Verwendung anderer Waschpuffer hilft hier nur schlecht, weil die Vorbereitung der Membran auf die spezielle Einschritt-Immundetektion wichtig ist. Nach der Inkubation mit der ReadyTector®-Inkubationslösung mit den Antikörpern ist ebenfalls das Waschen wichtig, um Hintergrund zu vermeiden.

Nach der Inkubation mit der ReadyTector®-Inkubationslösung mit den Antikörpern ist das Waschen nötig, um ungebundene Antikörper (primäre und sekundäre) wegzuwaschen, um Hintergrund zu vermeiden. Hierbei ist es mitunter besser 4-mal zu Waschen, falls sonst der Hintergrund sichtbar wird. Dies ist abhängig vom Primär-Antikörper. Wenn man mit einem Primär-Antikörper Hintergrund bekommt, dann sollte man mit diesem Antikörper immer 4-mal waschen. Aber meist reicht der vorgeschlagene 3-malige Waschschritt aus, bevor man das Substrat dazugibt.